La FISETINA , senolitico por excelencia.

EBioMedicine. Octubre de 2018; 36: 18–28.

Publicado en línea el 29 de septiembre de 2018. doi:  10.1016/j.ebiom.2018.09.015

Identificador del programa: PMC6197652

Número de identificación personal: 30279143

La fisetina es un senoterapéutico que prolonga la salud y la esperanza de vida.

Matthew J. Yousefzadeh , ^a, 1 Yi Zhu , ^b, 1 Sara J. McGowan , ^a, 1 Luise Angelini , ^a, 1 Heike Fuhrmann-Stroissnigg , ^a Ming Xu , ^b Yuan Yuan Ling , ^a Kendra I. Melos , ^a Tamar Pirtskhalava , ^b Christina L. Inman , ^b Collin McGuckian , ^a Erin A. Wade , ^a Jonathon I. Kato , ^a Diego Grassi , ^a Mark Wentworth , ^c Christin E. Burd , ^d Edgar A. Arriaga , ^y Warren L. Ladiges , ^f Tamara Tchkonia , ^b James L. Kirkland , ^b Paul D. Robbins , ^a, ⁎ y Laura J. Niedernhofer ^a, ⁎

Abstracto

Fondo

La senescencia es un mecanismo supresor de tumores que se activa en las células estresadas para evitar la replicación del ADN dañado. Se ha demostrado que las células senescentes desempeñan un papel causal en el envejecimiento y las enfermedades relacionadas con la edad mediante enfoques genéticos y farmacológicos. Anteriormente demostramos que la combinación de dasatinib y el flavonoide quercetina es un potente senolítico que mejora numerosas afecciones relacionadas con la edad, como la fragilidad, la osteoporosis y las enfermedades cardiovasculares. El objetivo de este estudio fue identificar flavonoides con una actividad senolítica más potente.

Métodos

Se examinó un panel de polifenoles flavonoides para determinar su actividad senolítica utilizando fibroblastos murinos y humanos senescentes, impulsados ​​por estrés oxidativo y genotóxico, respectivamente. El flavonoide senoterapéutico más importante se probó en ratones que modelaban un síndrome progeroide que portaba un reportero de p16 ^INK4a -luciferasa y ratones de tipo salvaje envejecidos para determinar los efectos de la fisetina en los marcadores de senescencia, la histopatología relacionada con la edad, los marcadores de enfermedades, la expectativa de vida y la expectativa de vida. Se utilizaron explantos de tejido adiposo humano para determinar si los resultados se traducían.

Recomendaciones

De los 10 flavonoides analizados, la fisetina fue el senolítico más potente. El tratamiento agudo o intermitente de ratones progeroides y viejos con fisetina redujo los marcadores de senescencia en múltiples tejidos, en consonancia con un mecanismo senolítico intermitente. La fisetina redujo la senescencia en un subconjunto de células en tejido adiposo murino y humano, lo que demuestra la especificidad del tipo celular. La administración de fisetina a ratones de tipo salvaje en etapas avanzadas de la vida restableció la homeostasis tisular, redujo la patología relacionada con la edad y extendió la esperanza de vida media y máxima.

Interpretación

El producto natural fisetina tiene actividad senoterapéutica en ratones y en tejidos humanos. La intervención en etapas avanzadas de la vida fue suficiente para producir un potente beneficio para la salud. Estas características sugieren la viabilidad de su aplicación en estudios clínicos en humanos.

Subvenciones del NIH P01 AG043376 (PDR, LJN), U19 AG056278 (PDR, LJN, WLL), R24 AG047115 (WLL), R37 AG013925 (JLK), R21 AG047984 (JLK), P30 DK050456 (Adipocyte Subcore, JLK), un premio BIG de la Fundación Glenn/Federación Estadounidense para la Investigación del Envejecimiento (AFAR) (JLK), Glenn/AFAR (LJN, CEB), las fundaciones Ted Nash Long Life y Noaber (JLK), el Grupo Connor (JLK), Robert J. y Theresa W. Ryan (JLK) y una subvención de la Asociación de Minnesota (AMAY-UMN#99)-P004610401–1 (JLK, EAA).

Palabras clave: senolítico, envejecimiento, progeria, longevidad, esperanza de vida, senescencia

Investigación en contexto

Evidencia antes de este estudio

La focalización farmacológica de los mecanismos fundamentales del envejecimiento tiene la capacidad de reducir la gravedad o retrasar la aparición simultánea de múltiples comorbilidades asociadas con la edad. Un mecanismo clave que se ha demostrado que impulsa el envejecimiento es la senescencia celular, por la cual la acumulación de daño en el ADN y/u otros factores estresantes celulares hace que las células proliferantes o terminalmente diferenciadas que no se dividen entren en un estado caracterizado por cambios profundos en la cromatina y el secretoma, mayor expresión del inhibidor del ciclo celular p16 ^Ink4a en muchas células senescentes, pero no en todas, detención de la replicación y resistencia a la apoptosis. Las células senescentes pueden desarrollar un fenotipo secretor asociado a la senescencia (SASP), que tiene efectos paracrinos y sistémicos nocivos. Las células senescentes son raras en individuos jóvenes, pero aumentan con la edad en múltiples tejidos. Se han identificado fármacos capaces de matar selectivamente a las células senescentes, denominados senolíticos, incluida la combinación de dastinib y quercetina (D ± Q), que mejora muchos aspectos del envejecimiento en modelos de ratones de envejecimiento acelerado y natural. Sin embargo, es probable que se necesiten medicamentos más seguros y mejorados dirigidos a la senescencia para eliminar de forma segura las células senescentes de múltiples órganos o incluso dentro de un solo tejido.

Valor añadido del estudio

Este estudio identifica al polifenol flavonoide fisetina como un fármaco con mayor actividad senoterapéutica en células cultivadas que la quercetina. Además, la fisetina mostró una potente actividad senoterapéutica in vivo . El tratamiento de ratones progeroides y de tipo salvaje envejecidos de forma aguda o intermitente con fisetina redujo los marcadores de senescencia en múltiples tejidos y en un subconjunto de tipos de células en el tejido adiposo. Es importante destacar que la administración crónica de fisetina a ratones de tipo salvaje en etapas tardías de la vida mejoró la homeostasis tisular, suprimió la patología relacionada con la edad y extendió la esperanza de vida media y máxima. Este resultado, similar a un informe reciente sobre la combinación de D ± Q, es el primero en documentar la extensión tanto de la esperanza de vida como de la esperanza de vida mediante un senolítico con pocos efectos secundarios, a pesar de que la administración se inició en etapas tardías de la vida.

Implicaciones de toda la evidencia disponible

En conjunto, estos datos establecen que el producto natural fisetina es un potente senoterapéutico, capaz de reducir la carga de células T, NK, progenitoras y endoteliales senescentes del tejido adiposo, y demuestran que reducir la carga de células senescentes en ratones, incluso en etapas avanzadas de la vida, es suficiente para tener un impacto significativo en la salud. Dado el perfil de seguridad conocido de la fisetina en humanos, se están iniciando ensayos clínicos para probar si la fisetina se puede utilizar de manera efectiva para reducir la carga de células senescentes y aliviar la disfunción en sujetos de edad avanzada.

1. Introducción

Se prevé que la focalización farmacológica de los mecanismos fundamentales del envejecimiento reduzca la gravedad o retrase la aparición de múltiples comorbilidades asociadas con la edad simultáneamente [ [5] , [6] , [7] ]. Un mecanismo clave demostrado que impulsa el envejecimiento es la senescencia celular, por la cual la acumulación de daño del ADN y/u otros factores estresantes celulares [ [1] , [2] , [3] , [4] ] hace que las células proliferantes [ 8 , 9 ] o terminalmente diferenciadas que no se dividen [ [10] , [11] , [12] , [13] ] entren en un estado caracterizado por profundos cambios en la cromatina y el secretoma, mayor expresión del inhibidor del ciclo celular p16 ^Ink4a , detención replicativa y resistencia a la apoptosis [ 1 , 14 ]. Las células senescentes pueden desarrollar un fenotipo secretor asociado a la senescencia (SASP), que consiste en citocinas proinflamatorias, quimiocinas y proteínas que degradan la matriz extracelular [ [15] , [16] , [17] , [18] ], que tiene efectos paracrinos y sistémicos nocivos [ [19] , [20] , [21] ]. De hecho, incluso una abundancia relativamente baja de células senescentes es suficiente para causar disfunción tisular [ 22 ]. Las células senescentes son raras en individuos jóvenes, pero aumentan con la edad en múltiples tejidos, incluido el tejido adiposo, el músculo esquelético, el riñón y la piel de todos los vertebrados evaluados [ 22 , 23 ].

El papel de las células senescentes en el deterioro relacionado con la edad fue identificado por estudios que demostraron los beneficios terapéuticos de la limpieza de células senescentes de ratones INK-ATTAC progeroides o de envejecimiento natural utilizando un gen suicida expresado solo en células que expresan p16 ^Ink4a (JLK, TT, JM van Deursen y DJ Baker [todos Mayo Clinic] diseñaron la estrategia INK-ATTAC [ 19 , 20 , [24] , [25] , [26] ]). Por el contrario, la inyección de células senescentes es suficiente para impulsar afecciones relacionadas con la edad, como osteoartritis, fragilidad y disminución de la supervivencia [ 26 , 27 ]. Por lo tanto, se anticipó que el desarrollo de terapias que matan selectivamente a las células senescentes retrasaría la aparición de fenotipos de envejecimiento, atenuaría la gravedad de las enfermedades relacionadas con la edad, mejoraría la resiliencia y aumentaría la supervivencia. Es importante destacar que también se predijo que las terapias senolíticas podrían administrarse de forma intermitente, lo que serviría para reducir la carga de células senescentes al tratarlas trimestralmente o incluso anualmente, lo que minimiza el riesgo de efectos secundarios [ 28 , 29 ].

Previamente identificamos fármacos que matan selectivamente a las células senescentes usando un paradigma de descubrimiento impulsado por hipótesis [ 30 ]. Las células senescentes son resistentes a la apoptosis debido a la regulación positiva de las vías antiapoptóticas de células senescentes (SCAP) [ 28 , 29 ]. La focalización de las SCAP en cultivos celulares usando una combinación de dasatinib y quercetina, un inhibidor de los miembros de la vía de prosupervivencia BCL-2, Navitoclax, o el inhibidor más específico de BCL-xL, A1331852, da como resultado la apoptosis de algunos, pero no de todos los tipos de células senescentes [ [30] , [31] , [32] , [33] ]. El tratamiento de ratones con dasatinib más quercetina (D + Q) mejora la fracción de eyección cardíaca y aumenta la reactividad vascular en ratones viejos después de un solo ciclo de tratamiento de 3 días [ 30 , 34 ]. Además, el tratamiento con D + Q disminuye la calcificación vascular y aumenta la reactividad vascular en ratones ApoE ^{−/− hipercolesterolémicos alimentados con una dieta rica en grasas después de tres ciclos de tratamiento mensuales de 3 días [} 34 ]. El tratamiento oral intermitente con D + Q mejora la función pulmonar y reduce la fibrosis pulmonar en un modelo murino inducido por bleomicina de fibrosis pulmonar idiopática [ 35 ], reduce la esteatosis hepática inducida por una dieta rica en grasas [ 36 ], alivia el deterioro de la marcha causado por la irradiación de las piernas [ 30 ] y reduce la osteoporosis en ratones viejos [ 10 ]. Finalmente, D + Q también disminuye la fragilidad, la osteoporosis, la pérdida de glicosaminoglicanos del disco intervertebral y la espondilosis en el modelo de ratón Ercc1 ^−/Δ de un síndrome progeroide humano después del tratamiento intermitente [ 30 ]. De manera similar, Navitoclax, que disminuye la abundancia de algunos pero no todos los tipos de células senescentes humanas y de ratón in vitro [ 33 ], reduce la disfunción hematológica causada por la radiación de cuerpo entero [ 31 ] y reduce las células espumosas íntimas/macrófagos similares a células senescentes en las placas vasculares en ratones LdlR ^{−/− alimentados con alto contenido de grasa [} 37 ]. El tratamiento con A1331852 reduce los colangiocitos senescentes y la fibrosis hepática en ratones Mdr2 ^{−/− [} 38 ]. En conjunto, estos estudios demuestran que los compuestos senolíticos pueden tener efectos significativos en las enfermedades degenerativas crónicas y la patología relacionada con la edad.

Sin embargo, no todas las células senescentes son iguales. Las células senescentes pueden expresar diferentes factores SASP, marcadores de senescencia y, lo que es más importante, utilizar diferentes mecanismos para resistir la apoptosis [ 30 , 39 ]. Además, ciertas terapias contra el cáncer se dirigen a las SCAP, por ejemplo , Navitoclax, y podrían reutilizarse como senolíticos, pero causan una toxicidad considerable que incluye neutropenia y deficiencia de plaquetas [ 40 , 41 ]. Por lo tanto, se necesitan medicamentos senoterapéuticos nuevos y mejorados y enfoques combinatorios para eliminar las células senescentes de manera segura de múltiples órganos o incluso dentro de un solo tejido [ [28] , [29] , [30] , 42 ].

Aquí, examinamos un panel de flavonoides para la actividad senoterapéutica para determinar si podíamos mejorar la quercetina. En fibroblastos embrionarios murinos primarios inducidos a la senescencia a través del estrés oxidativo y en fibroblastos humanos inducidos a la senescencia con la genotoxina etopósido, la fisetina fue más eficaz para reducir los marcadores de senescencia. La fisetina también redujo los marcadores de senescencia en ratones progeroides Ercc1 ^−/∆ y ratones WT envejecidos, así como en explantos humanos de tejido adiposo. El tratamiento con fisetina extendió la salud y la esperanza de vida en ratones WT incluso cuando el tratamiento se inició en animales viejos. Este flavonoide es un compuesto natural presente en muchas frutas y verduras como manzanas, caquis, uvas, cebollas, pepinos y fresas [ 43 , 44 ], lo que sugiere que es inminentemente traducible. Es importante destacar que no se han informado efectos adversos de la fisetina, incluso cuando se administra en dosis altas [ 45 ]. Por tanto, nuestros resultados sugieren que la suplementación o incluso el tratamiento intermitente con este producto natural y seguro podría mejorar el envejecimiento saludable, incluso en personas mayores.

 

 

2. Materiales y métodos

2.1. Productos químicos

Los productos químicos fueron de Sigma-Aldrich (St. Louis) a menos que se indique lo contrario. Los flavonoides fueron adquiridos de Selleckchem (Houston, TX): resveratrol (Cat # S1396), fisetina (Cat # S2298), luteolina (Cat # S2320), rutina (Cat # S2350), galato de epigalocatequina (EGCG, Cat # S2250), curcumina (Cat # S1848), pirfenidona (Cat # S2907) y miricetina (Cat # S2326). La apigenina, la catequina y la quercetina fueron adquiridas de Sigma-Aldrich (Cat # 1760595, # 1096790 y 1,592,409, respectivamente).

2.2 Animales

Todos los estudios con animales se llevaron a cabo de conformidad con la Guía para el cuidado y uso de animales de laboratorio del Departamento de Salud y Servicios Humanos de los EE. UU. y fueron aprobados por los Comités de cuidado y uso de animales institucionales de Scripps Florida o Mayo Clinic. Los ratones Ercc1 ^−/∆ se criaron como se describió previamente [ 46 ]. Los ratones reporteros de p16-luciferasa se obtuvieron de la Universidad Estatal de Ohio [ 47 ] y se criaron para crear una cepa albina C57BL/6 p16 ^Luc/+ ;Ercc1 ^+/− y FVB/n p16 ^+/Luc ;Ercc1 ^+/∆ . Estos ratones se cruzaron aún más para crear ratones f1 p16 ^+/Luc ;Ercc1 ^−/Δ con pelaje blanco para la obtención de imágenes. Todos los animales fueron genotipados a partir de una perforación de oreja por TransnetYX (Cordova, TN). Para los estudios de dieta, los ratones fueron alimentados con pienso Teklad 2020 (Envigo, Madison, WI) preparado con o sin 500 ppm (500 mg/kg) de fisetina (Indofine Chemical Co., Hillsborough, NJ) por Envigo. Co. (Tampa, FL). Para la administración oral de fisetina, los ratones recibieron una dosis de 100 mg/kg de fisetina en 60% Phosal 50 PG:30% PEG400:10% etanol o vehículo únicamente por sonda. Los estudios en ratones de tipo salvaje envejecidos se llevaron a cabo tanto en antecedentes genéticos f1 C57BL/6;FVB/n como endogámicos C57BL/6.

2.3. Aislamiento MEF

Los MEF Ercc1 ^−/− se aislaron de hembras preñadas en el día embrionario 13 (E13) y se cultivaron en una mezcla 1:1 de medio Eagle modificado de Dulbecco y F10 de Ham con 10% de suero bovino fetal, 1× aminoácidos no esenciales, penicilina y estreptomicina e incubados al 3% de O ₂ inicialmente, seguido de un cambio al 20% durante 5 pasajes para inducir la senescencia [ 48 ]. Las células fueron genotipadas por TransnetYX (Cordova, TN) y se analizaron de forma rutinaria para detectar contaminación por micoplasma utilizando el kit de detección de micoplasma MycoAlert PLUS (Lonza, Walkersville, MD).

2.4. Ensayos para identificar senoterapéuticos

Los MEF Ercc1 ^−/− se pasaron 5 veces al 20 % de O ₂ para inducir la senescencia y luego se sembraron a 5000 células por pocillo en placas de 96 pocillos al menos 6 h antes del tratamiento. Después de la adición de fármacos, los MEF se incubaron durante 24-48 h al 20 % de O ₂ . Posteriormente, se midió la actividad de SA-β-gal en tres experimentos independientes, como se describió anteriormente [ 49 ]. Brevemente, las células se lavaron con PBS y luego se agregaron 10 μM de C ₁₂ FDG en medio de cultivo fresco y se incubaron durante 2 h. Diez minutos antes del análisis, se agregó 2 μg/mL de colorante Hoechst. Se utilizó un IN Cell Analyzer 6000 para cuantificar el número total de células viables (Hoechst ⁺ ) y el número de células senescentes (C ₁₂ FDG ⁺ ). Todas las muestras se analizaron por duplicado con 3-5 campos por pocillo y se informaron como media ± DE. La actividad senoterapéutica se confirmó en fibroblastos humanos (IMR90). Las células se obtuvieron de la American Type Culture Collection (ATCC) y se cultivaron en medio EMEM con 10% FBS y antibióticos. Para inducir la senescencia, las células se trataron durante 24 h con 20 μM de etopósido. Dos días después de la eliminación del etopósido, ~70% de las células eran SA-β-gal ⁺ . Las células se trataron durante 48 h con diferentes concentraciones de fisetina (1-15 μM) y el porcentaje de células SA-β-gal ⁺ se determinó utilizando C ₁₂ FDG, como se describió anteriormente.

2.5. Detección de la actividad de la luciferasa mediante imágenes in vivo IVIS

A ratones anestesiados con isoflurano ( n  = 2–10 ratones por grupo) se les inyectó intraperitonealmente 10 μL por gramo de peso corporal de sustrato D-luciferina (Caliper Life Sciences, Hopkinton, MA; 15 mg/mL diluido en PBS estéril) y se les tomaron imágenes utilizando un IVIS Lumina (PerkinElmer, Billerica, MA), como se describió previamente [ 47 , 50 ].

2.6 Medición de la peroxidación lipídica

Los niveles de aductos de proteína 4-hidroxinonenal de lisados ​​de hígado ( n  = 4–6 ratones por grupo) preparados en tampón RIPA se midieron en los hígados de ratones utilizando el kit ELISA competitivo de aductos HNE OxiSelect (Cell Biolabs, San Diego, CA), como se describe [ 50 ].

2.7 Medición del glutatión

Se prepararon hígados murinos (n = 4–7 ratones por grupo) fijados en ácido sulfosalicílico al 5% y se analizaron para la concentración de glutatión reducido (GSH) y oxidado (GSSG) utilizando el kit de ensayo de glutatión (Cayman Chemical, Ann Arbor, MI), como se describe [ 50 ]. La absorbancia de la muestra se midió a 405 nm utilizando un lector de placas y se informó la relación de GSH:GSSG para cada muestra.

2.8. Química clínica

Se recolectó sangre completa ( n = 3 a 6 ratones por grupo) inmediatamente después de la eutanasia del animal a través de una punción cardíaca en tubos heparinizados para el análisis de las características químicas clínicas utilizando rotores VetScan Comprehensive Diagnostic Profile en un VestScan VS2 (Abaxis, Union City, CA).

2.9. Concentración sérica de MCP-1

Las concentraciones séricas de MCP-1 ( n  = 5 ratones por grupo) se midieron utilizando un ELISA de MCP-1 específico para ratones (Raybiotech, Norcross, GA), como se describe [ 51 ].

2.10. Histopatología

Los tejidos de los ratones se recogieron en la necropsia ( n  = 3–8 ratones por grupo) y se colocaron en formalina tamponada neutra al 10% durante 48 h, se transfirieron a alcohol al 70% y, posteriormente, se procesaron en bloques de parafina para su seccionamiento y tinción con hematoxilina y eosina. Un patólogo veterinario evaluó las secciones de tejido en función de la presencia y la gravedad de un panel bien definido de lesiones relacionadas con la edad para crear una puntuación compuesta de lesiones de tejido para cada animal que refleje la esperanza de vida saludable, como se describió anteriormente [ 52 ].

 

2.11. Aislamiento de ARN y PCR cuantitativa

Se extrajeron tejidos de ratones ( n  = 4–10 ratones por grupo) y se congelaron instantáneamente en nitrógeno líquido. Se extrajo el ARN total de los tejidos y se midió la expresión de varios marcadores de senescencia, como se describió previamente en [ 51 ]. El ARN total se cuantificó utilizando un espectrofotómetro Nanodrop (Thermo Fisher, Waltham, MA) y se utilizó 1 μg de ARN total para generar ADNc utilizando el kit de síntesis de ADNc Transcriptor First Strand (Roche, Basilea, Suiza). Los cambios de expresión génica se llevaron a cabo en reacciones de 20 μL utilizando la mezcla maestra Universal SYBR Green con ROX (Roche) y un termociclador StepOne (Thermo Fisher). Los cebadores para los genes de interés son los siguientes: Cdkn1a ( p21 ^Cip1 ) Fwd 5′-GTCAGGCTGGTCTGCCTCCG-3′, Cdkn1a ( p21 ^Cip1 ) Rev. 5′-CGGTCCCGTGGACAGTGAGCAG-3′; Cdkn2a ( p16 ^Ink4a ) Fwd 5′- CCCAACGCCCCGAACT -3′, Cdkn2a ( p16 ^Ink4a ) Rev. 5′- GCAGAAGAGCTGCTACGTGAA-3′; Gapdh Fwd 5′-AAGGTCATCCCAGAGCTGAA-3′, Gapdh Rev. 5′-CTGCTTCACCACCTTCTTGA-3′; Il6 Fwd 5′-CTGGGAAATCGTGGAAT-3′, Il6 Rev. 5′-CCAGTTTGGTAGCATCCATC-3′; Mcp1 Fwd 5′-GCATCCACGTGTTGGCTCA-3′, Mcp1 Rev. 5′-CTCCAGCCTACTCATTGGGATCA-3′. Los datos se analizaron mediante el método ΔΔCt y la expresión génica se normalizó a Gapdh .

2.12. Aislamiento de linfocitos T CD3 ^{+ de sangre periférica}

Se obtuvo sangre de ratones (n  = 4–10 ratones por grupo) post mortem mediante punción cardíaca, se colocó inmediatamente en 1/10 del volumen de EDTA 0,5 M y se mezcló suavemente para evitar la coagulación. Las muestras se centrifugaron a 300  g durante 10 min en una centrífuga de sobremesa. Se descartó el sobrenadante y el sedimento celular se resuspendió en 1 ml de tampón ACK (150 mM NH4Cl _, 10 mM KHCO3 _, 0,1 mM Na2EDTA _, pH 7,4) y se incubó a temperatura ambiente durante 10 min para lisar los glóbulos rojos. Las células se centrifugaron y se repitió la lisis de ACK. Las células se centrifugaron, se lavaron con PBS y se resuspendieron en PBS que contenía 0,5 % de FBS y 2 mM de EDTA. Se añadieron cincuenta μL de conjugado CD3-Biotina (Miltenyi Biotech, San Diego, CA) a la suspensión celular y se incubaron durante 30 min en hielo. Las células se centrifugaron a 100  g durante 10 min y se lavaron dos veces en tampón de resuspensión. El pellet celular se resuspendió en 500 μL de tampón de resuspensión y se añadieron 100 μL de microesferas anti-biotina seguido de una incubación de 15 min en hielo. Las células se lavaron dos veces y luego se resuspendieron en 500 μL de tampón de resuspensión y se aplicaron a una columna MACS unida a un imán. Las células se lavaron con 3 volúmenes de columna de tampón de resuspensión antes de la elución. Las células se centrifugaron y se realizó el aislamiento de ARN utilizando un kit RNeasy (Qiagen, Germantown, MD) de acuerdo con las especificaciones del fabricante. El análisis de qPCR de los marcadores de senescencia se realizó como se indicó anteriormente.

2.13. Tinción de tejido con β-galactosidasa asociada a la senescencia (SA-β-gal)

Los tejidos grasos frescos ( n  = 6–7 ratones por grupo) se fijaron y tiñeron para detectar la actividad de β-galactosidasa asociada a la senescencia, como se describe [ 53 ].

2.14. Citometría de masas/CyTOF en tejido adiposo

Esta técnica de proteómica unicelular de alta dimensión combina la espectrometría de masas de tiempo de vuelo con la tecnología de marcaje de metales para detectar hasta 40 dianas proteicas por célula [ 54 , 55 ]. Se diseñó un panel de anticuerpos basado en marcadores de superficie celular y factores de transcripción (ver Tabla complementaria 1) para el análisis CyTOF de tejidos adiposos. Cada anticuerpo se marcó con un isótopo de metal raro y su función se verificó mediante citometría de masas de acuerdo con el manual de fábrica (Multi Metal labeling Kits, Fluidigm, CA). Se utilizó un citómetro de masas CyTOF-2 (Fluidigm, South San Francisco, CA) para la adquisición de datos. Los datos adquiridos se normalizaron en función de perlas de normalización (Ce140, Eu151, Eu153, Ho165 y Lu175). Se disoció un gramo de tejido graso subcutáneo ( n  = 6–9 ratones por grupo) en una suspensión de células individuales utilizando un kit de disociación de tejido adiposo (Adult Adipose Tissue Disociation Kit, Miltenyi Biotec Inc. CA). Las células recolectadas se incubaron con anticuerpos conjugados con metales para marcadores de superficie celular y proteínas intracelulares. La fijación y permeabilización se llevaron a cabo de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Transcription Factor Staining Buffer Set, eBioscience, San Diego, CA). Los datos de CyTOF fueron analizados por Cytobank (Santa Clara, CA).

2.15. Explantos de tejido adiposo humano

El protocolo fue aprobado por la Junta de Revisión Institucional para Investigación Humana de la Fundación Clínica Mayo. Se obtuvo el consentimiento informado de todos los sujetos ( n  = 3). Se resecó tejido adiposo omental mayor humano durante la cirugía de 2 sujetos femeninos delgados (IMC 25,5 y 26,2) y 1 obeso (IMC 45,6), con edades comprendidas entre 55 y 66 años. No se sabía que ningún sujeto tuviera una malignidad. El tejido adiposo se cortó en trozos pequeños y se lavó con PBS 3 veces. Luego, el tejido adiposo se cultivó en un medio que contenía piruvato de sodio 1 mM, glutamina 2 mM, vitaminas MEM, aminoácidos no esenciales MEM y antibióticos con 20 μM de fisetina o DMSO. Después de 48 h, los explantos adiposos se lavaron 3 veces con PBS y luego se mantuvieron en el mismo medio sin medicamentos durante 24 h para recolectar medio acondicionado (CM) para el análisis de proteínas multiplex. Luego, los explantos adiposos se fijaron y tiñeron para detectar la actividad de β-galactosidasa asociada a la senescencia [ 85 ].

2.16. Análisis de proteínas multiplex

Los niveles de citocinas proinflamatorias y quimiocinas en CM de los explantos de tejido adiposo ( n  = 3) se midieron utilizando la tecnología Luminex xMAP. El análisis de multiplexación se realizó utilizando el sistema Luminex™ 100 (Luminex, Austin, TX) de Eve Technologies Corp. (Calgary, Alberta, Canadá). Los kits de multiplexación humana eran de Millipore (Billerica, MA). Los niveles de proteína secretada en CM se normalizaron a los pesos del tejido y se representaron gráficamente como un porcentaje relativo al control del vehículo.

3. Resultados

Previamente demostramos que el flavonoide quercetina, un antioxidante, que también se dirige a la PI3 quinasa delta así como a ciertos miembros de la familia BCL-2, reduce la senescencia en células endoteliales de la vena umbilical humana primarias (HUVECs) y fibroblastos embrionarios murinos (MEFs), especialmente cuando se usa en combinación con el inhibidor de la tirosina quinasa dasatinib [ 30 ]. Para determinar si otros flavonoides podrían tener una actividad senoterapéutica más potente que la quercetina, se examinó un panel de flavonoides para determinar los efectos sobre la senescencia inducida por estrés oxidativo [ 49 ]. Se utilizaron MEF primarios de ratones Ercc1 ^{−/− . Estas células experimentan senescencia prematura si se cultivan con oxígeno atmosférico [} 56 ]. Los cultivos de MEF Ercc1 ^−/− se establecieron al 3% de O2 _y luego se cambiaron al 20% de O2 _durante tres pases para inducir la senescencia. Para cuantificar las células senescentes, se midió la actividad de SA-ß-gal utilizando el sustrato fluorescente C ₁₂ FDG [ 57 ] utilizando un generador de imágenes confocal IN Cell Analyzer 6000. A una dosis de 5 μM, la fisetina fue más eficaz para reducir la fracción de MEF positivos para SA-ß-gal (Figura 1A). La luteolina y la curcumina también mostraron una actividad débil en una dosis en la que la quercetina fue ineficaz. Además, la fisetina redujo la senescencia en las células MEF e IMR90 de manera dependiente de la dosis (Figura 1B y C). Estos resultados son consistentes con nuestro hallazgo previo de que la fisetina reduce selectivamente la viabilidad de las HUVEC senescentes sin afectar las células proliferantes [ 32 ]. En las HUVEC, la fisetina induce apoptosis medida por la actividad de la caspasa 3/7, mientras que en los MEF, la fisetina suprimió los marcadores de senescencia sin evidencia de muerte celular [ 32 ].

Figura 1

Identificación de fisetina como un senolítico putativo. (A) Los MEF Ercc1 ^−/− del pasaje 5 se trataron con un panel de compuestos flavonoides a una dosis de 5 μM y se midió la viabilidad de las células senescentes (células SA-β-gal ⁺ detectadas mediante tinción con C ₁₂ FDG; barras rojas) y células totales (barras negras) utilizando un IN Cell Analyzer 6000. El número de células viables se calcula en relación con las células tratadas solo con vehículo (DMSO). n  = 3 experimentos independientes, ANOVA unidireccional. (B) Cuantificación del número total de MEF Ercc1 ^−/− viables y MEF Ercc1 ^−/− senescentes viables después de tratar cultivos mixtos de células proliferantes y senescentes con varias dosis de fisetina a partir de dos réplicas biológicas realizadas por triplicado. Prueba t de Student bilateral no pareada . (C) Las células IMR90 de pasaje temprano se trataron durante 24 h con 20 μM de etopósido. Dos días después de la eliminación del etopósido, ~70% de las células eran SA-β-gal ⁺ . Las células se trataron durante 48 h con diferentes concentraciones de fisetina (1–15 μM) y el porcentaje de células SA-β-gal ⁺ se determinó utilizando C ₁₂ FDG, como se describió anteriormente. Se grafican el número relativo de células viables en comparación con los cultivos tratados solo con vehículo (DMSO). Todas las muestras se analizaron por duplicado con 3–5 campos por pocillo y se informaron como la media ± DE Prueba t de Student no pareada de dos colas . Se grafica la media ± SEM. * p  < .05, ** p  < .01, *** p  < .001, **** p  < .0001.

Para probar la actividad senoterapéutica de la fisetina in vivo , inicialmente se utilizaron ratones progeroides Ercc1 ^{−/∆ que portaban} un transgén reportero p16 ^Ink4a -luciferasa [ 47 , 50 ]. Estos ratones muestran una acumulación acelerada de células senescentes en comparación con los ratones WT, pero el nivel general de senescencia nunca excede el de los ratones envejecidos naturalmente [ 50 ]. Los ratones Ercc1 ^−/∆ ; p16 ^Ink4a -luciferasa fueron alimentados con una dieta estándar Teklad 2020 con o sin suplementación con 500 ppm (500 mg/kg) de fisetina, ad libitum (aproximadamente 60 mg/kg de fisetina por día). Los ratones fueron expuestos a una dieta de fisetina de forma intermitente desde las 6 a las 8 y luego a las 12-14 semanas de edad. La actividad de la luciferasa de todo el cuerpo se midió antes de comenzar la dieta de fisetina y luego semanalmente a partir de entonces. Los animales de los dos grupos de tratamiento tenían una señal de luciferasa equivalente antes de la administración de la dieta experimental. La fisetina dietética suprimió la señal de luciferasa de los ratones Ercc1 ^−/∆ ; p16 ^Ink4a -luciferasa de manera significativa (Figura 2AB). La señal de luciferasa fue menor en cada punto temporal después del inicio de la dieta con fisetina (Figura 2BC). En particular, el nivel de expresión de p16 ^Ink4a se mantuvo significativamente más bajo en los ratones tratados con fisetina durante el período de 4 semanas en que los animales no estuvieron expuestos a la fisetina (8-12 semanas de edad,Figura 2B). Esto es consistente con un mecanismo de acción en el que las células senescentes se eliminan (senolítico) o se revierte la senescencia (senomórfico), pero no un mecanismo en el que la fisetina debe estar presente crónicamente para suprimir la senescencia.

Figura 2

El tratamiento intermitente de ratones progeroides con fisetina reduce la carga de células senescentes. (A) Imagen representativa de ratones p16 ^+/Luc ;Ercc1 ^−/∆ machos de 12 semanas de edad de la misma edad alimentados con una dieta que contenía 500 ppm (500 mg/kg) de fisetina o una dieta de control sin fármaco. (B) La señal de luciferasa se midió quincenalmente en ratones p16 ^+/Luc ;Ercc1 ^−/∆ alimentados con pienso de control o pienso que contenía 500 ppm de fisetina, n = 4–10 ratones por grupo y punto temporal. La fisetina se administró de forma intermitente durante dos semanas a la vez (barras amarillas). De lo contrario, los ratones fueron alimentados con una dieta de control. (C) Los mismos datos que se observan en (B), pero representados como el cambio porcentual en la señal de luciferasa a medida que los animales envejecían. Valores representados como la media ± SEM. Prueba t  de Student bilateral no pareada . ***p < .001, ****p < .0001.

Para validar los datos de las imágenes, se trató a los ratones Ercc1 ^{−/∆ con una dieta de 500 ppm de fisetina durante 10 semanas a partir de las 10 semanas de edad, luego se recolectaron tejidos para medir múltiples marcadores de senescencia, incluidos} p16 ^Ink4a y p21 ^Cip1 y factores SASP. Se incluyó la expresión de p21 ^Cip1 ya que no todas las células senescentes son positivas a p16 ^Ink4a : algunas son positivas a p21 ^Cip1 , pero negativas a p16 ^Ink4a . Como se muestra enFigura 3El ARNm de AD, p16 ^Ink4a y p21 ^Cip1 , así como los marcadores SASP, se elevaron significativamente en la grasa, el bazo, el hígado y el riñón de los ratones Ercc1 ^−/∆ en comparación con los ratones WT de la misma edad. La fisetina redujo significativamente la expresión de los marcadores de senescencia y SASP en todos los tejidos. De manera similar, hubo una reducción en la expresión de p16 ^Ink4a , p21 ^Cip1 y los factores SASP en las células T CD3 ^{+ de sangre periférica (}Figura 3E), un tipo de célula que demuestra un aumento robusto en la expresión de p16 ^INK4a a medida que los humanos envejecen [ 58 ]. Además, la fisetina redujo el estrés oxidativo en el hígado, como se determinó midiendo los aductos del producto de peroxidación lipídica 4-hidroxinonenal (HNE) y un aumento en la proporción de glutatión reducido a oxidado (Figura 3FG), en consonancia con los datos que indican que la fisetina tiene actividad antioxidante y además aumenta el glutatión intracelular [ 45 ].

Figura 3

El tratamiento crónico con fisetina reduce la senescencia en ratones progeroides. (AD) Se analizaron tejidos de ratones Ercc1 ^−/∆ machos y hembras de 20 semanas de edad expuestos crónicamente a fisetina a través de su dieta o alimentados con una dieta de control para la expresión de marcadores de senescencia ( p16 ^Ink4a y p21 ) y fenotipo secretor asociado a senescencia (SASP) ( Il1β , Il6 , Il10, Tnfα, Cxcl2 , Mcp1 y Pai1 ) utilizando qRT-PCR. Se utilizaron tejidos de ratones WT de la misma edad para normalizar la expresión. n  = 4–10 ratones por grupo. Se grafica la media ± SEM ANOVA unidireccional con prueba de comparación múltiple de Tukey. (E) Cuantificación de marcadores de senescencia y SASP en células T periféricas CD3 ⁺ aisladas de los mismos ratones. Los niveles de ARNm se midieron mediante qRT-PCR. (F) Los aductos de 4-hidroxinonenal (HNE) se midieron en el hígado (n = 4-5 ratones por grupo) mediante ELISA como índice de estrés oxidativo. (G) El glutatión reducido (GSH) y oxidado (GSSG) se cuantificaron en el hígado (n = 4-5 ratones por grupo) como índice de capacidad de amortiguación antioxidante. Las diferencias se evaluaron mediante la prueba t de Student bilateral no pareada . Los valores se representan como la media ± SEM. * p  < .05, ** p  < .01, *** p  < .001, **** p  < .0001.

Para confirmar aún más los datos obtenidos en ratones progeroides, empleamos ratones C57BL/6 envejecidos naturalmente y diferentes métodos para detectar la senescencia en el tejido. Se trató a ratones de 22 a 24 meses con 100 mg/kg de fisetina durante 5 días consecutivos por sonda oral o solo con vehículo. Los ratones se sacrificaron 3 días después de la última dosis y se determinó el número de células SA-ß-gal ⁺ presentes en la grasa inguinal tiñendo secciones de tejido para medir la actividad de SA-β-gal. Se eligió tejido graso para el análisis porque hay una clara regulación positiva de los marcadores de senescencia, incluido SASP en nuestros modelos de ratón, el tejido tiene un aumento significativo en la fracción de células senescentes, incluidas las células inmunes senescentes, como las células T y endoteliales y los macrófagos, y la inyección de preadipocitos senescentes es suficiente para inducir fragilidad en ratones jóvenes [ 26 , 50 , 59 , 60 ]. El tratamiento a corto plazo con fisetina redujo significativamente la fracción de células senescentes en el tejido adiposo blanco (WAT). Para determinar qué células se vuelven senescentes en el WAT y qué tipos de células son eliminados por la fisetina, se realizó un análisis CyTOF en el tejido adiposo subcutáneo de ratones INK-ATTAC envejecidos que expresaban una proteína FKBP-Casp8 marcada con Flag del promotor p16 ^{Ink4a (}Figura 4B). La etiqueta Flag permitió la identificación de células senescentes ( que expresan p16 ^Ink4a ) utilizando un anticuerpo anti-Flag. El análisis CyTOF reveló una fracción significativamente elevada de células senescentes en la grasa de ratones viejos en comparación con los jóvenes e identificó estas células como células madre/progenitoras mesenquimales, linfocitos T, células asesinas naturales y células endoteliales (Figura 4C). El tratamiento de corta duración con fisetina resultó en una reducción significativa de la fracción de células senescentes en cada una de estas poblaciones (Figura 4C). La fisetina redujo la fracción de células madre/progenitoras que expresaban p16 ^Ink4a , c-Kit ^{+, células T CD4 +} y CD8 ⁺ , células NK-1.1 ⁺ y células endoteliales CD146 ⁺ CD31 ^{+ (}Figura 4C). Estos datos también se muestran en el análisis Spanning-tree Progression Analysis of Density-normalized Events (SPADE) (Fig. 1 suplementaria). Para confirmar la senescencia en estas poblaciones celulares, se midió la proteína CENP-B mediante CyTOF (Figura 4D). CENP-B se une al ADN satélite centromérico [ 61 ], que se distiende en las células senescentes. La fracción de células CENP-B ⁺ en el tejido adiposo blanco aumentó significativamente en ratones viejos en comparación con los jóvenes y se suprimió al tratar a los ratones con un tratamiento corto de fisetina, de la misma manera que las células que expresan p16 ^Ink4a /FLAG ⁺ . Por el contrario, la expresión de p21 ^Cip1 (otro regulador del ciclo celular que a menudo se regula positivamente en las células senescentes) no aumentó significativamente en estas poblaciones celulares (Fig. 2 suplementaria). Si bien las células dendríticas FLAG ⁺ y los macrófagos aumentaron en el tejido adiposo blanco de ratones viejos de acuerdo con un informe anterior [ 62 ], el tratamiento con fisetina no tuvo un efecto sustancial en la fracción de macrófagos o células dendríticas con alto p16 ^Ink4a , CENP-B o p21 ^Cip1 (Fig. 3 suplementaria). En conjunto, estos datos demuestran que un tratamiento breve con fisetina reduce la cantidad de células que expresan p16 ^Ink4a en el tejido adiposo blanco subcutáneo, incluidas las células madre/progenitoras mesenquimales, las células inmunes y las endoteliales. Esta es la primera vez que se ha demostrado que un senoterapéutico afecta de manera diferencial a las células senescentes de diferentes linajes in vivo .

Figura 4

El tratamiento agudo con fisetina reduce la carga de células senescentes en ratones de tipo salvaje envejecidos y explantos humanos. (A) Se administró fisetina (100 mg/kg) o vehículo a ratones WT C57BL/6 de 22 a 24 meses de edad durante 5 días por sonda oral. 72 h después de la dosis final, se sacrificó a los ratones y se cuantificaron las células SA-β-gal ^{+ en la grasa inguinal (} n = 6-7 ratones por grupo). Prueba t  de Student bilateral no pareada , ** p  < .01. (B) Diagrama esquemático del transgén INK-ATTAC [ 25 ]. La expresión de la proteína FKBP-Caspasa-8 marcada con FLAG está impulsada por el promotor p16 ^Ink4a que permite la detección de células que expresan p16 en tejidos mediante inmunodetección de FLAG. (C) Se trató de forma aguda a ratones macho INK-ATTAC de edad avanzada (22-24 meses) con fisetina como se describió anteriormente y se utilizó el análisis CyTOF para cuantificar las poblaciones de células p16 ^Ink4a /FLAG ⁺ en el tejido graso subcutáneo (células madre mesenquimales c-kit ⁺ , células T CD4 ⁺ y CD8 ⁺ , células NK-1.1 ⁺ y CD146 ⁺ CD31 ⁺ para células endoteliales). Se utilizó como control el tejido graso subcutáneo de ratones macho de 6 meses de edad. (D) Cuantificación de otro marcador de senescencia celular en las mismas poblaciones celulares (células CENP-B ⁺ ). Los datos se representan como la media ± SEM en función de n  = 9 ratones por grupo. ANOVA unidireccional con prueba de comparación múltiple de Tukey. (E) Los explantos de tejido adiposo humano ( n  = 3) se trataron con 20 μM de fisetina durante 48 h, luego se lavaron y se colocaron en medio fresco durante 24 h para acondicionarlo. Luego, los explantos de tejido adiposo se tiñeron para medir el porcentaje de células SA-ß-gal+. (F) Los niveles de citocinas y quimiocinas se midieron en el medio acondicionado a partir de los explantos de tejido adiposo utilizando análisis de proteínas multiplex y se normalizaron al peso del tejido adiposo (n = 3 réplicas biológicas). Los resultados se representan como el porcentaje de expresión de varias citocinas en relación con las muestras del mismo individuo tratado solo con vehículo. Prueba t de Student pareada de dos colas . Valores representados como la media ± SEM. *p < .05, **p < .01, *** p  < .001.

Para determinar si la fisetina también reduce la senescencia en el tejido adiposo humano, se trataron con fisetina ex vivo explantos adiposos omentales mayores resecados durante la cirugía . Los explantos de tejido se trataron durante 48 h con 20 μM de fisetina, se lavaron y se cultivaron durante 24 h adicionales antes de medir los factores SASP mediante análisis de proteínas multiplex [ 26 ]. El tratamiento con fisetina provocó una reducción significativa en el porcentaje de células positivas a SA-ß-gal (Figura 4E) así como en la expresión de los factores SASP IL-6, IL-8 y MCP-1 en el tejido adiposo blanco humano (Figura 4F). Estos datos respaldan el potencial traduccional de la fisetina para reducir la carga de células senescentes y la inflamación asociada.

Para determinar si la eliminación de células senescentes mediada por fisetina afecta la salud o la expectativa de vida de los ratones, se alimentó a ratones WT f1 C57BL/6:FVB con una dieta que contenía 500 ppm de fisetina a partir de las 85 semanas de edad, aproximadamente equivalente a los 75 años de edad en humanos. Esto resultó en una extensión de la expectativa de vida media y máxima (Figura 5AB). La amilasa y la alanina aminotransferasa (ALT) fueron significativamente más bajas en el suero de ratones WT envejecidos alimentados con la dieta suplementada con fisetina, en consonancia con una mejor homeostasis pancreática y hepática (Figura 5C) Se tiñeron secciones de tejido de cerebro, riñón, hígado, pulmón y pata delantera con hematoxilina y eosina y fueron evaluadas por un patólogo veterinario. Utilizando la Plataforma de Clasificación de Geropatología para puntuar las lesiones relacionadas con la edad [ 63 ], varios tejidos presentaron una patología relacionada con la edad reducida en el grupo de dieta con fisetina en comparación con la dieta de control (Figura 5D) Un ejemplo de esto se ilustra en una imagen representativa de secciones renales enFigura 5E. De manera similar a los ratones progeroides, la fisetina redujo la expresión de marcadores de senescencia y SASP en múltiples tejidos de ratones WT envejecidos expuestos a fisetina oral (Figura 5FI). Además, hubo una reducción en la senescencia y la expresión del factor SASP en las células T CD3 ^{+ periféricas (}Figura 5J) También hubo una reducción en los niveles circulantes de MCP-1 (Figura 5K), un factor SASP [ 51 ]. Finalmente, la fisetina redujo el estrés oxidativo en el hígado de ratones WT viejos (Figura 5(LM-L)

Figura 5

La intervención tardía con fisetina en ratones viejos de tipo salvaje extiende la expectativa de vida y la longevidad. (A) A las 85 semanas de edad (>20 meses), se administró a ratones machos y hembras una dieta que contenía 500 ppm (500 mg/kg) de fisetina o se les alimentó con una dieta de control sin fármaco. Se midió la expectativa de vida. n  = 8-9 ratones por grupo. Prueba de log rank (Mantel-Cox). (B) Promedio de expectativa de vida de la misma cohorte de ratones. Cada punto representa un animal individual. Las barras negras indican la media ± SEM Prueba t de Student no pareada de dos colas. (C) Química clínica en sangre de los ratones anteriores para medir marcadores de disfunción hepática (alanina aminotransferasa/ALT) y pancreática (amilasa/AMY). n = 3-6 ratones por grupo. Prueba t de Student no pareada de dos colas . (D) Puntuaciones de lesiones compuestas para patologías relacionadas con la edad en múltiples tejidos determinadas por análisis histopatológico según los criterios de la Plataforma de clasificación de geropatía [ 63 ]. n = 3–8 ratones por grupo. Prueba t de Student bilateral no pareada . (E) Imágenes representativas del riñón de un ratón alimentado con pienso de control o pienso con fisetina. En el ratón de control, las flechas (de izquierda a derecha) indican una mayor celularidad en un segmento del borde de la cápsula glomerular, niveles moderados de agregados linfoides y vacuolización de células tubulares. En el ratón tratado con fisetina, la flecha indica solo una celularidad segmentaria leve en el borde de la cápsula glomerular y unas pocas células linfoides dispersas cerca del glomérulo (aumento de 200×). (FI)—Se analizaron tejidos de ratones de >120 semanas de edad (~30 meses) alimentados con pienso de control o con fisetina para detectar la presencia de marcadores de senescencia ( p16 ^Ink4a y p21 ) y de fenotipo secretor asociado a senescencia (SASP) ( Il1β , Il6 , Il10, Tnfα, Cxcl2 , Mcp1 y Pai1 ) mediante qRT-PCR. Los resultados se expresan en función de los valores en ratones WT “Young” de 16 a 18 semanas de edad. n = 4 a 10 ratones por grupo. ANOVA unidireccional con prueba de comparación múltiple de Tukey. (J) Se midió la expresión del marcador de senescencia y SASP en células T periféricas CD3 ⁺ mediante qRT-PCR. Los resultados se expresan en función de los valores en ratones WT “Young” de 16 a 18 semanas de edad. n = 4 a 6 ratones por grupo. ANOVA unidireccional con prueba de comparación múltiple de Tukey. (K) Se midieron los niveles circulantes de la quimiocina MCP-1 del factor SASP mediante ELISA. n = 5 ratones por grupo. ANOVA de una vía con prueba de comparación múltiple de Tukey. (L) El 4-hidroxinonenal (HNE) forma un aducto, un marcador de peroxidación lipídica y estrés oxidativo medido mediante ELISA en el hígado. n = 5–6 ratones por grupo. Prueba t  de Student bilateral no pareada-test. (M) Se midió la proporción de glutatión reducido (GSH) a oxidado (GSSG) como índice de estrés oxidativo. n = 6-7 ratones por grupo. Valores representados como media ± SEM. Prueba t de Student bilateral no pareada . *p < .05, **p < .01, ***p < .001, ****p < .0001.

4. Discusión

El envejecimiento es un proceso complejo que involucra numerosas vías y componentes tanto genéticos como ambientales [ [64] , [65] , [66] , [67] , [68] , [69] ]. Los procesos biológicos que impulsan el proceso de envejecimiento contribuyen a la etiología de la mayoría de las enfermedades crónicas, incluyendo: 1) inflamación crónica, «estéril»; 2) cambios macromoleculares en proteínas, carbohidratos, lípidos, mitocondrias y ADN; 3) disfunción de células madre y progenitoras; y 4) aumento de la senescencia celular [ 5 , 70 ]. Estos procesos están vinculados en el sentido de que las intervenciones que se dirigen a uno parecen atenuar otros. Por ejemplo, las células senescentes se acumulan con la edad y en los sitios de patogénesis en enfermedades crónicas [ 5 , 70 ]. La reducción de la carga de células senescentes puede conducir a una inflamación reducida, una disfunción macromolecular disminuida y una función mejorada de las células madre/progenitoras [ 1 , 3 , 19 ]. Las células madre adultas también se vuelven disfuncionales con la edad, mostrando evidencia de senescencia [ 71 ]. Anteriormente demostramos que la combinación de dasatinib y quercetina funciona como un senolítico in vivo , aliviando muchas enfermedades relacionadas con la edad [ 26 , 30 ]. Debido a la actividad senoterapéutica de la quercetina, examinamos otros flavonoides naturales para detectar efectos sobre las células senescentes con la esperanza de mejorar la eficacia terapéutica.

En este trabajo, demostramos que, cuando se probó frente a un panel de otros flavonoides, la fisetina tuvo los efectos senoterapéuticos más potentes en varios tipos de células in vitro y mostró fuertes efectos antigerónicos in vivo . Demostramos que el tratamiento agudo (oral) o crónico (dietético) de ratones progeroides y WT con fisetina reduce los marcadores de senescencia y el fenotipo secretor asociado a la senescencia en múltiples tejidos (Figura 3ANUNCIO,​Anuncio,4A,4A,​A,5F-I).5FI). Estos datos se recopilaron en dos laboratorios utilizando ratones progeroides y WT en dos antecedentes genéticos distintos. Específicamente, se eliminaron células madre/progenitoras mesenquimales, linfocitos T, células asesinas naturales y células endoteliales que expresaban p16 ^Ink4a o CENP-B ⁺ de la grasa subcutánea de ratones viejos, pero no macrófagos similares a senescentes activados ni células dendríticas. El efecto de la fisetina fue mayor en las células que expresaban p16 ^Ink4a que en las que expresaban p21 ^CIP1 , al menos en la grasa subcutánea (Figura 4). Nuestros hallazgos revelan que la fisetina se dirige a múltiples tipos de células senescentes, pero no a todos, in vivo . Además, al reducir el porcentaje de células senescentes, la fisetina reduce la expresión de marcadores de senescencia en múltiples órganos, medidos mediante PCR cuantitativa. Esto da como resultado una mejor homeostasis tisular y una reducción de múltiples patologías relacionadas con la edad, en consonancia con los efectos sobre un proceso fundamental de envejecimiento.

El hecho de que la fisetina redujera la fracción de células T y NK senescentes podría ayudar a amplificar los efectos beneficiosos de la fisetina, ya que las células inmunes sanas son importantes para eliminar las células senescentes [ 72 , 73 ]. De manera similar, la fisetina reduce los marcadores de inflamación y estrés oxidativo (Figuras 3FG y​y5L-M),5LM), en consonancia con la literatura previa [ 45 ]. Esto también podría contribuir a la reducción de los marcadores de senescencia. La disminución de estos marcadores se observó en tejidos recolectados varios días después de completar la administración de fisetina. Dado que las semividas rápida y terminal de la fisetina son 0,09 y 3,1 h respectivamente [ 74 ], estas mejoras no dependieron de la presencia continua de fisetina circulante. Esto es más consistente con la fisetina que causa la eliminación de células senescentes, que tardan días a semanas en formarse después de una agresión (al menos en cultivo), que con los efectos ejercidos por la ocupación continua de un receptor o los efectos sobre una enzima. Sin embargo, es importante señalar que dadas las múltiples actividades reportadas de flavonoides como la fisetina, también es posible que la extensión de la esperanza de vida saludable se deba a mecanismos adicionales a la reducción de la senescencia, como la alteración del microbioma intestinal [ 75 ].

La fisetina extiende la vida replicativa de S. cerevisiae en un 55% [ 76 ] y la vida útil de D. melanogaster en un 23% [ 77 ]. Aquí, mostramos por primera vez un efecto similar en animales vertebrados. La exposición crónica a la fisetina mejora la esperanza de vida y extiende la esperanza de vida media y máxima de los ratones. Es importante destacar que en nuestro estudio la suplementación con fisetina se inició en ratones de más de 20 meses de edad. Esto aumenta el potencial traslacional de nuestro estudio ya que las intervenciones senoterapéuticas se administran de manera más factible en humanos de edad avanzada después de la aparición de enfermedades relacionadas con la edad, en lugar de en sujetos asintomáticos más jóvenes, en quienes cualquier efecto secundario sería inaceptable.

La fisetina es un miembro de la familia de los flavonoides, una familia de compuestos polifenólicos naturales. La fisetina, un antioxidante con un alto equivalente al Trolox, está presente en bajas concentraciones en muchas frutas y verduras como manzanas, caquis, uvas, cebollas y pepinos y en concentraciones más altas en las fresas [ 43 , 44 ]. La ingesta dietética promedio de fisetina natural en Japón es de aproximadamente 0,4 mg/día [ 78 , 79 ], aparentemente sin efectos adversos. La fisetina tiene actividad anticancerígena y parece bloquear la vía PI3K/AKT/mTOR [ 80 ]. Anteriormente, descubrimos que la interrupción transitoria de la vía PI3K/AKT por interferencia de ARN conduce a la muerte de células senescentes [ 30 ], al igual que con otras SCAP que defienden a las células senescentes de su propia SASP proapoptótica [ 28 , 29 ]. La fisetina, como otros flavonoides, es un inhibidor de la topoisomerasa, lo que también puede contribuir a su actividad anticancerígena [ 81 ]. Aumenta la actividad catalítica de hSIRT1 al menos in vitro [ 76 ]. También in vitro , la fisetina inhibe la actividad de varias citocinas proinflamatorias, incluyendo TNFα, IL-6 y el factor de transcripción NF-κB [ 82 ]. La fisetina tiene actividad directa como agente reductor, reaccionando químicamente con especies reactivas de oxígeno y neutralizándolas [ 83 , 84 ]. La fisetina elimina radicales libres como resultado de su capacidad de donación de electrones, que se debe a la presencia de dos grupos hidroxilo en un anillo y un tercer grupo hidroxilo en otro anillo. La fisetina también regula positivamente la síntesis de glutatión, un antioxidante endógeno [ 43 , 82 ]. Otras actividades biológicas incluyen efectos antihiperlipidémicos [ [84] , [85] , [86] ], antiinflamatorios [ 85 ] y neurotróficos [ 87 ], algunos de los cuales podrían estar mediados por una reducción en la carga de células senescentes, particularmente porque cuando se administra de manera intermitente, la fisetina alivia la disfunción a pesar de su corta vida media de eliminación, más consistente con la eliminación de células senescentes que con la acción sobre un receptor o enzima que requiere la presencia continua del fármaco.

La estructura química de la fisetina es casi la misma que la de la quercetina, excepto por un grupo hidroxilo en la posición 5. Por lo tanto, es muy probable que estos dos compuestos estrechamente relacionados ejerzan muchos efectos similares. Curiosamente, la química medicinal preliminar de la fisetina ha identificado análogos con una actividad senoterapéutica mejorada, lo que sugiere que se pueden desarrollar flavonoides aún más eficaces para prolongar la vida útil con pequeñas alteraciones en la estructura de la fisetina.

Dado que la fisetina es un producto natural que se encuentra en alimentos comunes y está disponible como un suplemento dietético oral y no tiene efectos secundarios adversos reportados [ 45 ], nuestros datos preclínicos sugieren que la fisetina debería ser inminentemente traducible y podría tener un beneficio significativo para la salud de los pacientes de edad avanzada. Con base en estos estudios con ratones, actualmente se están realizando ensayos clínicos para evaluar los beneficios a corto plazo del tratamiento intermitente con fisetina en ciertos aspectos del envejecimiento, como la fragilidad.

Contribuciones del autor

MJY y JIK realizaron los análisis de los marcadores de senescencia y SASP en los tejidos de los ratones tratados; YZ realizó los análisis de CyTOF con la supervisión y el análisis de EAA; SJM, KM, EAW, CM y LA realizaron los estudios de tratamiento con ratones en el Scripps Research Institute; TP y CLI realizaron los estudios con ratones en Mayo Clinic; HF, DG y YYL realizaron las pruebas de flavonoides en cultivos celulares; MX realizó el análisis en explantos de tejido adiposo humano; WLL realizó análisis de histopatología; CEB proporcionó los ratones p16 ^INK4a -Luc ^+/− y ayudó con los análisis; TT, JLK, EAA, PDR y LJN supervisaron todo el diseño experimental, el análisis de datos y la preparación del manuscrito.

Intereses financieros en competencia

Mayo Clinic posee las patentes de los fármacos senolíticos (PCT/US2016/041646). Esta investigación ha sido revisada por el Comité de Revisión de Conflictos de Intereses de Mayo Clinic y se llevó a cabo de conformidad con las políticas de Mayo Clinic sobre conflictos de intereses. Ninguno de los demás autores tiene un conflicto de intereses económico relevante.